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本试剂盒是基于PCR原理向目的DNA片段（一般为质粒）中引入碱基的点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)等。一般宿主菌培养扩增的质粒DNA是甲基化的，PCR扩增新合成的DNA是非甲基化的。首先以待突变的甲基化质粒为模板，利用快速超高保真的HiPfu聚合酶实现突变质粒的合成（非甲基化，包含突变点，且有两个缺刻点nick点），再利用Dpn I酶选择性降解甲基化的模板质粒，剩下的新合成非甲基化的突变质粒转入大肠杆菌后，质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。一般可以产生大于90%的突变效率。

• 简单，一个PCR管中完成所有操作，速度最快。
  
• 采用部分重叠引物设计，使PCR呈指数扩增，扩增产物凝胶电泳可见增加成功率。
  
• 效率高，使用Dpn I去除非突变模板，突变效率高达90%；不需要使用特殊感受态细胞降解非突变质粒。
  
• 采用分子进化改造的HiPfu可以提供4倍～6倍于pfu的扩增速率提高和3倍于pfu的超高保真性。

• 引物包含5'端重叠区和3'端延伸区。5'端重叠区长度大约18～20bp，3'端延伸区长度大约是10～12bp。
  
• 突变位点设计在5'端重叠区的中间位置，突变位点的左侧5'端大约7～9bp，右侧3'端20～22bp。
  
• 引物应该选择PAGE或者更高的纯化方式，3'端为一个或者更多个G/C结尾。
  
• 举例：氨基酸V(GTA)连续突变3个碱基成为R(CGT)。
  

• 建议25μL PCR反应体系：
  

  成分	用量
  Template	2～10ng
  Forward Primer (10μM)	1μL
  Reverse Primer (10μM)	1μL
  10×HiPfu Buffer	2.5μL
  10mM dNTPs	1μL
  HiPfu DNA Polymerase	0.5μL
  ddH2O	至25μL

  
  
• PCR循环：
  

  温度	时间	循环数
  94℃	3～5min	1
  94℃	20sec	25～30
  55℃	20sec
  72℃	2kb/min
  72℃	10min	1

  注意：一般选择2kb/min扩增，但是扩增时间通常可以在1kb/20～40秒范围内调整。
  
• 电泳检测：
  取5μL PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。如能看见目的条带(或者见到目的条带外还有其它条带），则可预判基本成功；注意即使未见条带，也可以继续进行后续步骤，但是成功几率大大降低。
  
• PCR产物的消化：
  直接加0.5μL DpnI酶于PCR产物中（约20μL），充分混匀，继续PCR仪器上37℃孵育1小时（不用热盖）。注意：Dpn I含甘油，易沉底，一定要吹打混匀。如果非突变质粒较多，可以延长消化时间到3～5小时。
  
• 转化：
  加入5～10μL DpnI酶消化产物于50μL～100μL感受态细胞中(效率≥10的8次方)，轻弹混匀，冰浴30分钟。按照标准转化步骤转化，最后将菌液铺板，培养过夜（为得到较多的克隆，4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100～150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜）。
  注意：应该选择效率高的感受态细胞，如无克隆生长，或克隆数少，可以将20μL消化产物全部转入200μL感受态细胞中，或者把Dpn I酶消化后的产物用常规的乙醇沉淀浓缩，这样就可以把所有的产物全部用于转化。